PRÁCTICA 18: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HEMOGLOBINA POR EL MÉTODO DE DRAVKIN

17.02.2020

FUNDAMENTO

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.

OBJETIVO:

Determinar la concentración de hemoglobina en una muestra de sangre.

UTILIDAD CLÍNICA:

La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.

Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

MATERIALES NECESARIOS

• Tubos de ensayo

• Pipetas automáticas

• Puntas de pipeta
• Lanceta

• Pipeta de 5ml y auxiliar de pipeteo

• Cubetas de fotometría

• Gradilla para cubetas

• Gradillas

APARATAJE

Espectrofotómetro

REACTIVOS:

HEMOGLOBIN 50x :

• Ferricianuro de potasio 0,60 mmol/L
• Cianuro de potasio 77 mmol/l
• Dihidrógeno de potasio. 2 mmol/L

HEMOGLOBIN CAL.

Se trata de un patrón de hemoglobina, de origen animal, 15g/dL

MUESTRA.

Sangre capilar.

Tomamos la muestra directamente con una micropipeta a partir de la punción con lanceta.

PRECAUCIONES:

El reactivo es tóxico en caso de ingestión, contacto con la piel o inhalación. Por ello es necesario cumplir los protocolos y tener cuidado en su manipulación.

Este dato también hay que tenerlo en cuenta a la hora de eliminar los residuos ya que tendremos que contar con un contenedor para residuos tóxicos químicos.

PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE TRABAJO O REACTIVO DE DRAVKIN.

5mL:       4,9 mL de agua destilada + 2 gotas de Reactivo. (lo mezclamos directamente en el tubo de ensayo)

PROCEDIMIENTO:

Encendemos el espectrofotómetro un rato antes y atemperamos los reactivos.

1. Condiciones del ensayo:

Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540 nm

Cubeta: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz

Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15-25ºC

2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente al blanco, éste contiene Reactivo de Dravkin. De esta forma pretendemos eliminar las interferencias de la cubeta y del reactivo.

Vamos a realizar el MÉTODO MICRO.

3. Pipetear:

4.- Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (15-25ºC).

5. Leer la absorbancia (A) del calibrador y la muestra, frente al blanco de reactivo.

Una vez preparados los tres tubos necesarios procedemos a medir su absorbancia.

RESULTADOS Y CÁLCULOS.

• Absorbancia del blanco =        0
  

• Absorbancia del patrón =         0,242
  

• Absorbancia de la muestra =   0,213
  

• (Am-Ab)/(Ap-Ab)= (0,213/0,242)x15 = 13,20g/dL
  

VALORES DE REFERENCIA.

Al tratarse de una determinación cuantitativa, necesitamos unos valores de referencia con los que poder comparar nuestros resultados.

Hombres: 14-18 g/dL = 8,7-11,2 mmol/L

Mujeres  : 12-16 g/dL = 7,5-9,9   mmol/L

Estos valores son orientativos, es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

RESULTADOS:

13,20 g/dL

Se encuentra dentro de la normalidad.

PRÁCTICA 17: DETECCIÓN DE LA REACCIÓN DE LA FOSFATASA ALCALINA EN LEUCOCITOS

11.02.2020

PRINCIPIO

La reacción de peroxidasa, en particular la reacción citoquimicamente significativa de mieloperoxidasa, sirve de indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. El grado de madurez de los granulocitos en maduración puede ser estimado esencialmente según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca. Las peroxidasas son catalasas lisosomales que transfieren el hidrógeno desde un donador adecuado (anteriormente la bencidina cangerígena, aqui: 4-cloro1-naftol) a un peróxido (aquí: peróxido de hidrógeno). Entonces el donador 4-cloro-1-naftol se oxida y se transforma en un colorante insoluble pardo negruzco, que puede utilizarse corno indicador de la correspondiente actividad de peroxidasas. 

MATERIAL.

• Lancetas.
• Portaobjetos.
• Cubetas de Hellerdahl.
• Microscopio

REACTIVOS

El kit de tinción contiene  

• Reactivo 1: LEUCOGNOST® ALPA Tris(hidroximetil)-aminometano 
• Reactivo 2:  LEUCOGNOST® ALPA Fosfato de 1-naftilo sal sódico 
• Reactivo 3:  LEUCOGNOST® ALPA Variamin® sal azul B 1 cuchara dosificadora 

 Además también es necesario: 

• Art.  108562 Aquatex® frasco gotero de 50 ml   (medio de montaje acuoso)    para microscopía 
• Art.  109249 Hemalumbre en solución según Mayer   500 ml, 1 l,   para microscopía 2,5 l 
• Art.  112327 LEUCOGNOST® mezcla fijadora 500 ml   para citoquímica de enzimas

PREPARACIÓN DE REACTIVOS.

Solución de tinción 

• Solución A: Mezclamos 100 mL de agua destilada con 4 cucharaditas de Reactivo 1

• Solución B: Mezclamos 15 mL de solución A con el contenido completo del Reactivo 2.

• Solución de Tinción: Mezclamos el Reactivo 3 completo, 45 mL de solución A filtrada y la solución B . 

La solución de tinción preparada es utilizable durante 90 minutos como máximo. La coloración propia de la solución reactiva es pardo rojiza y se enturbia rápidamente.  La turbidez no influye en la calidad de la tinción.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS 

Hemos utilizado sangre capilar con la que hemos realizado un frotis.

Los frotis han de ser secados al aire durante 30 minutos como mínimo, debiéndose fijar éstos antes de la reacción citoquímica propiamente sumergiéndolas durante 3 minutos en solución fijadora.

Enjuagar con agua corriente del grifo 30 segundos Secar al aire 

Después de la fijación los frotis podrán ser almacenados hasta 3 días en el frigorífico

TÉCNICA.

Tinción en la cubeta de 60 ml de Hellendahl 

Los portaobjetos han de ser inmersos y movidos brevemente en las soluciones, la simple introducción proporcionará resultados de tinción insuficientes. Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de soluciones. Para conseguir un óptimo resultado de tinción, deberían respetarse los períodos indicados.

Portaobjeto con frotis fijado 

• Introducir en solución de tinción recién preparada 30 minutos 

• Introducir en agua destilada 5 minutos
  

• Contratinción con hemalumbre en solución según Mayer 5 minutos 

• Enjuagar con agua corriente del grifo 5 minutos
• Secar al aire 

Para el almacenamiento de preparados hematológicos durante varios meses se recomienda el montaje con un medio de montaje acuoso y un cubreobjetos. Sin montaje, la tinción tendrá una estabilidad de unos 3 días.

RESULTADO.

Se pueden observar las granulaciones

PRÁCTICA 16: DETECCIÓN DE LA REACCIÓN DE LA PEROXIDASA EN LEUCOCITOS

11.02.2020

PRINCIPIO

La reacción de peroxidasa, en particular la reacción citoquimicamente significativa de mieloperoxidasa, sirve de indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. El grado de madurez de los granulocitos en maduración puede ser estimado esencialmente según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca. Las peroxidasas son catalasas lisosomales que transfieren el hidrógeno desde un donador adecuado (anteriormente la bencidina cangerígena, aqui: 4-cloro1-naftol) a un peróxido (aquí: peróxido de hidrógeno). Entonces el donador 4-cloro-1-naftol se oxida y se transforma en un colorante insoluble pardo negruzco, que puede utilizarse corno indicador de la correspondiente actividad de peroxidasas. 

MATERIAL

• Lancetas.
• Portaobjetos.
• Cubetas de Hellerdahl.
• Microscopio

REACTIVOS

El kit de tinción contiene 

• Reactivo 1: LEUCOGNOST® POX 4-Cloro-1-naftol  12 x 75 µmol 
• Reactivo 2:  LEUCOGNOST® POX Tris(hidroximetil)aminometano-  HCl solución tampón 10 ml 
• Reactivo 3:  LEUCOGNOST® POX Solución de peróxido de hidrógeno 5 ml 

MUESTRA:

• Sangre periférica.

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Preparación de la solución fijadora LEUCOGNOST

Esto lo realizó un grupo de clase que consiste en mezclar 9 partes de metanol por una de formol, como hicieron un total de 200 mL se preparó con 20 mL de formol y 180 mL de metanol y seguidamente se repartieron alícuotas para cada grupo de clase.

Preparación de solución de tinción.

Ya cada grupo preparó una solución de tinción para cada uno, se añaden juntos:

• Disolvimos el contenido total del frasco de reactivo 1 (4-cloro-1-naftol) e, 15 mL de etanol
• Añadimos a una cubeta de 60 ml de  Hellendahl. 
• Añadimos 45 mL de agua destilada revolviendo
• Añadimos 10 gotas de reactivo 2 (tris(hidroximetil)amino-metano-HCl solución tampón) revolviendo. 
• Añadimos 2 gotas de reactivo  3 (solución de peróxido de hidrógeno) revolviendo.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Hemos utilizado sangre capilar con la que hemos realizado un frotis. (el cual se realizó media hora antes de iniciar esta práctica)

Los frotis han de fueron secados al aire durante 30 minutos, debiéndose fijar éstos antes de la reacción citoquímica propiamente sumergiéndolas durante 3 minutos en solución fijadora.

Enjuagamos con agua corriente del grifo 30 segundos y luego lo secamos al aire 

TINCIÓN EN LA CUBETA DE 60 mL DE HELLERDAHL.

NOTA: Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de soluciones, además que para conseguir un óptimo resultado de tinción, deberían respetarse los períodos indicados.

Primero, tras prepararlo todo y haber dejado secar las extensiones sanguíneas el tiempo correspondiente, se enjuagó 3 minutos en la solución fijadora. Tras ello se enjuagó 10 segundos con agua destilada y se dejó secar.
Luego  se introdujo en la solución de tinción recién preparada 10  minutos, se enjuaga con agua destilada 10 segundos y se seca al aire. Seguidamente se realiza una contratinción con hemalumbre en solución según Mayer 2 minutos, se enjuaga con agua corriente del grifo 5 minutos y por ultimo se vuelve a secar al aire.

RESULTADO.

Tras secarse la preparación observamos con el objetivo de 40x donde se podían observar diversas granulaciones.

EVALUACIÓN. 

Las poblaciones leucémicas de blastos que reaccionan de forma peroxidasapositiva en parte o en su totalidad son indicadores de la leucemia mieloica aguda (LMA/AML). Los linfoblastos y las células linfoideas importantes para al diagnóstico diferencial siempre deberían ser peroxidasa-negativas, y los bastoncillos de Auer - que acompañan una leucemia mieloica aguda - tendrán una tinción especialmente intensa. No obstante, en caso de presentarse una reacción negativa de peroxidasas, no se podrá excluir sin más la presencia de una leucemia mieloica aguda. Para poder clasificar con claridad las diferentes formas de la leucemia mieloica aguda (mieloblástica, promielocítica y mielomonocítica) habrá que realizar una reacción adicional de esterasa. Si la reacción de esterasas es positiva en menos del 50 %, se tendrá que obtener el porcentaje exacto de células peroxidasapositivas en la correspondiente población de blastos realizando un contado. Sin embargo, no será necesario diferenciar las células peroxidasa/esterasa-positivas adicionalmente según los grados de intensidad.