PRÁCTICA 17: DETECCIÓN DE LA REACCIÓN DE LA FOSFATASA ALCALINA EN LEUCOCITOS

11.02.2020

PRINCIPIO

La reacción de peroxidasa, en particular la reacción citoquimicamente significativa de mieloperoxidasa, sirve de indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. El grado de madurez de los granulocitos en maduración puede ser estimado esencialmente según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca. Las peroxidasas son catalasas lisosomales que transfieren el hidrógeno desde un donador adecuado (anteriormente la bencidina cangerígena, aqui: 4-cloro1-naftol) a un peróxido (aquí: peróxido de hidrógeno). Entonces el donador 4-cloro-1-naftol se oxida y se transforma en un colorante insoluble pardo negruzco, que puede utilizarse corno indicador de la correspondiente actividad de peroxidasas. 

MATERIAL.

• Lancetas.
• Portaobjetos.
• Cubetas de Hellerdahl.
• Microscopio

REACTIVOS

El kit de tinción contiene  

• Reactivo 1: LEUCOGNOST® ALPA Tris(hidroximetil)-aminometano 
• Reactivo 2:  LEUCOGNOST® ALPA Fosfato de 1-naftilo sal sódico 
• Reactivo 3:  LEUCOGNOST® ALPA Variamin® sal azul B 1 cuchara dosificadora 

 Además también es necesario: 

• Art.  108562 Aquatex® frasco gotero de 50 ml   (medio de montaje acuoso)    para microscopía 
• Art.  109249 Hemalumbre en solución según Mayer   500 ml, 1 l,   para microscopía 2,5 l 
• Art.  112327 LEUCOGNOST® mezcla fijadora 500 ml   para citoquímica de enzimas

PREPARACIÓN DE REACTIVOS.

Solución de tinción 

• Solución A: Mezclamos 100 mL de agua destilada con 4 cucharaditas de Reactivo 1

• Solución B: Mezclamos 15 mL de solución A con el contenido completo del Reactivo 2.

• Solución de Tinción: Mezclamos el Reactivo 3 completo, 45 mL de solución A filtrada y la solución B . 

La solución de tinción preparada es utilizable durante 90 minutos como máximo. La coloración propia de la solución reactiva es pardo rojiza y se enturbia rápidamente.  La turbidez no influye en la calidad de la tinción.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS 

Hemos utilizado sangre capilar con la que hemos realizado un frotis.

Los frotis han de ser secados al aire durante 30 minutos como mínimo, debiéndose fijar éstos antes de la reacción citoquímica propiamente sumergiéndolas durante 3 minutos en solución fijadora.

Enjuagar con agua corriente del grifo 30 segundos Secar al aire 

Después de la fijación los frotis podrán ser almacenados hasta 3 días en el frigorífico

TÉCNICA.

Tinción en la cubeta de 60 ml de Hellendahl 

Los portaobjetos han de ser inmersos y movidos brevemente en las soluciones, la simple introducción proporcionará resultados de tinción insuficientes. Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de soluciones. Para conseguir un óptimo resultado de tinción, deberían respetarse los períodos indicados.

Portaobjeto con frotis fijado 

• Introducir en solución de tinción recién preparada 30 minutos 

• Introducir en agua destilada 5 minutos
  

• Contratinción con hemalumbre en solución según Mayer 5 minutos 

• Enjuagar con agua corriente del grifo 5 minutos
• Secar al aire 

Para el almacenamiento de preparados hematológicos durante varios meses se recomienda el montaje con un medio de montaje acuoso y un cubreobjetos. Sin montaje, la tinción tendrá una estabilidad de unos 3 días.

RESULTADO.

Se pueden observar las granulaciones