PRÁCTICA 16: DETECCIÓN DE LA REACCIÓN DE LA PEROXIDASA EN LEUCOCITOS

11.02.2020

PRINCIPIO

La reacción de peroxidasa, en particular la reacción citoquimicamente significativa de mieloperoxidasa, sirve de indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. El grado de madurez de los granulocitos en maduración puede ser estimado esencialmente según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca. Las peroxidasas son catalasas lisosomales que transfieren el hidrógeno desde un donador adecuado (anteriormente la bencidina cangerígena, aqui: 4-cloro1-naftol) a un peróxido (aquí: peróxido de hidrógeno). Entonces el donador 4-cloro-1-naftol se oxida y se transforma en un colorante insoluble pardo negruzco, que puede utilizarse corno indicador de la correspondiente actividad de peroxidasas. 

MATERIAL

• Lancetas.
• Portaobjetos.
• Cubetas de Hellerdahl.
• Microscopio

REACTIVOS

El kit de tinción contiene 

• Reactivo 1: LEUCOGNOST® POX 4-Cloro-1-naftol  12 x 75 µmol 
• Reactivo 2:  LEUCOGNOST® POX Tris(hidroximetil)aminometano-  HCl solución tampón 10 ml 
• Reactivo 3:  LEUCOGNOST® POX Solución de peróxido de hidrógeno 5 ml 

MUESTRA:

• Sangre periférica.

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Preparación de la solución fijadora LEUCOGNOST

Esto lo realizó un grupo de clase que consiste en mezclar 9 partes de metanol por una de formol, como hicieron un total de 200 mL se preparó con 20 mL de formol y 180 mL de metanol y seguidamente se repartieron alícuotas para cada grupo de clase.

Preparación de solución de tinción.

Ya cada grupo preparó una solución de tinción para cada uno, se añaden juntos:

• Disolvimos el contenido total del frasco de reactivo 1 (4-cloro-1-naftol) e, 15 mL de etanol
• Añadimos a una cubeta de 60 ml de  Hellendahl. 
• Añadimos 45 mL de agua destilada revolviendo
• Añadimos 10 gotas de reactivo 2 (tris(hidroximetil)amino-metano-HCl solución tampón) revolviendo. 
• Añadimos 2 gotas de reactivo  3 (solución de peróxido de hidrógeno) revolviendo.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Hemos utilizado sangre capilar con la que hemos realizado un frotis. (el cual se realizó media hora antes de iniciar esta práctica)

Los frotis han de fueron secados al aire durante 30 minutos, debiéndose fijar éstos antes de la reacción citoquímica propiamente sumergiéndolas durante 3 minutos en solución fijadora.

Enjuagamos con agua corriente del grifo 30 segundos y luego lo secamos al aire 

TINCIÓN EN LA CUBETA DE 60 mL DE HELLERDAHL.

NOTA: Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de soluciones, además que para conseguir un óptimo resultado de tinción, deberían respetarse los períodos indicados.

Primero, tras prepararlo todo y haber dejado secar las extensiones sanguíneas el tiempo correspondiente, se enjuagó 3 minutos en la solución fijadora. Tras ello se enjuagó 10 segundos con agua destilada y se dejó secar.
Luego  se introdujo en la solución de tinción recién preparada 10  minutos, se enjuaga con agua destilada 10 segundos y se seca al aire. Seguidamente se realiza una contratinción con hemalumbre en solución según Mayer 2 minutos, se enjuaga con agua corriente del grifo 5 minutos y por ultimo se vuelve a secar al aire.

RESULTADO.

Tras secarse la preparación observamos con el objetivo de 40x donde se podían observar diversas granulaciones.

EVALUACIÓN. 

Las poblaciones leucémicas de blastos que reaccionan de forma peroxidasapositiva en parte o en su totalidad son indicadores de la leucemia mieloica aguda (LMA/AML). Los linfoblastos y las células linfoideas importantes para al diagnóstico diferencial siempre deberían ser peroxidasa-negativas, y los bastoncillos de Auer - que acompañan una leucemia mieloica aguda - tendrán una tinción especialmente intensa. No obstante, en caso de presentarse una reacción negativa de peroxidasas, no se podrá excluir sin más la presencia de una leucemia mieloica aguda. Para poder clasificar con claridad las diferentes formas de la leucemia mieloica aguda (mieloblástica, promielocítica y mielomonocítica) habrá que realizar una reacción adicional de esterasa. Si la reacción de esterasas es positiva en menos del 50 %, se tendrá que obtener el porcentaje exacto de células peroxidasapositivas en la correspondiente población de blastos realizando un contado. Sin embargo, no será necesario diferenciar las células peroxidasa/esterasa-positivas adicionalmente según los grados de intensidad.