07.10.19
OBJETIVO
Aprender a medir la hemoglobina en sangre venosa, a través de técnicas espectrofotométricas. La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada. Además la hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Y es la encargada del transporte de oxígeno. Un valor por debajo del normal puede indicar: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.
En cambio un nivel alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.
Material necesario:
- Espectrofotómetro.
- Cubetas de 1 cm de paso de luz.
- Pipetas de 5 y 10 mL y auxiliares.
- Probeta
- Micropipeta de 10 µL y puntas.
- Gradilla
- Tubos de ensayo
Reactivos:
- Hemoglobin 50 x Drabkin, compuesto de ferricianuro de potasio, cianuro de potasio y dihidrogeno fosfato de potasio.
- Hemoglobin cal, que es el PATRÓN de hemoglobina, de origen animal con una concentración de 15 g/dL.
OTROS DATOS: Medir a 540 nm de longitud de onda.
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| Material |
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| Reactivo y calibrador |
PROCEDIMIENTO
Lo primero que tenemos que tener en cuenta es que vamos a realizar el método micro, en el que se establecen las siguientes medidas:
Además para elaborar el reactivo de trabajo (RT):
_Para 5 mL: 4,9 mL de agua destilada + 2 gotas de reactivo
_Para 250 mL: 245 mL de agua destilada + 5 mL de reactivo (1 frasco)
Como eramos varios grupos en clase, decidimos hacer solo nuestro grupo el blanco y el patrón que emplearía el mismo todos los compañeros.
Al ser 5 grupos y teniendo en cuenta las medidas de la tabla, nos propusimos a preparar 20 mL de RT para que tuviésemos todos los de la clase. Para ello y para que esté en la misma proporción que lo que establece el protocolo, debemos mezclar 19,60 mL de agua destilada + 8 gotas de reactivo
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| Cálculos realizados |
Antes de nada, encendemos el espectrofotómetro.
Cuando ha pasado unos 10 minutos seleccionamos 540 nm de longitud de onda
1. Preparamos la gradilla con 2 tubos de ensayo.
2. Vertemos agua destilada en un vaso de precipitados y con una pipeta cogemos 19,6 mL y lo vertemos en una probeta.
3. Posteriormente echamos 8 gotas del reactivo en el agua de la probeta.
4. Mezclamos un poco.
5. Con la pipeta cogemos 2,5 mL de RT y lo echamos en uno de los tubos de ensayo. Este será el blanco
6. Seguidamente cogemos otros 2,5 mL de RT y se echa en el otro tubo, a continuación con una micropipeta se coge 10 µL de hemoglobin cal (calibrador) y se echa sobre el RT. Se homogeneiza con la micropipeta.
7. Tras ello cogimos otra gradilla con 5 tubos de ensayo y echamos 2,5 mL de RT en cada uno de ellos y solo en uno echamos 10 µL de muestra de sangre, antes se agita un poco y tras echarla sobre el RT se cierra con un tapón y se mueve levemente. Realizamos el mismo movimiento con el blanco y el patrón.
8. Los otros cuatro tubos se reparten a los otros grupos para que echen su cantidad de muestra correspondiente
- La medición obtenida fue demasiado alta por lo que podría deberse a que la sangre la teníamos en el laboratorio y llevaba más de un año extraída, cuando en condiciones normales como mucho se habría de esperar unos días máximo.
- No es necesario ajustar el blanco en los siguientes grupos una vez que ya lo ajustamos nosotros.
- Teníamos esa sangre en el laboratorio, pero debe obtenerse sangre por punción venosa y se usan anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato.
