PRÁCTICA 2: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HEMOGLOBINA

07.10.19

OBJETIVO

Aprender a medir la hemoglobina en sangre venosa, a través de técnicas espectrofotométricas. La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada. Además la hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Y es la encargada del transporte de oxígeno. Un valor por debajo del normal puede indicar: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.
En cambio un nivel alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.

Material necesario:

•  Espectrofotómetro.
• Cubetas de 1 cm de paso de luz.
•  Pipetas de 5 y 10 mL y auxiliares.
•  Probeta
•  Micropipeta de 10 µL y puntas.
•  Gradilla
• Tubos de ensayo

Reactivos: 

•  Hemoglobin 50 x Drabkin, compuesto de ferricianuro de potasio, cianuro de potasio y dihidrogeno fosfato de potasio. 
• Hemoglobin cal, que es el PATRÓN de hemoglobina, de origen animal con una concentración de 15 g/dL.

OTROS DATOS: Medir a 540 nm de longitud de onda.

Material

Reactivo y calibrador

PROCEDIMIENTO

Lo primero que tenemos que tener en cuenta es que vamos a realizar el método micro, en el que se establecen las siguientes medidas:

Además para elaborar el reactivo de trabajo (RT):

_Para 5 mL:  4,9 mL de agua destilada + 2 gotas de reactivo

_Para 250 mL: 245 mL de agua destilada + 5 mL de reactivo (1 frasco)

Como eramos varios grupos en clase, decidimos hacer solo nuestro grupo el blanco y el patrón que emplearía el mismo todos los compañeros.

Al ser 5 grupos y teniendo en cuenta las medidas de la tabla, nos propusimos a preparar 20 mL de RT para que tuviésemos todos los de la clase. Para ello y para que esté en la misma proporción que lo que establece el protocolo, debemos mezclar 19,60 mL de agua destilada + 8 gotas de reactivo

Cálculos realizados

Antes de nada, encendemos el espectrofotómetro.

Cuando ha pasado unos 10 minutos seleccionamos 540 nm de longitud de onda

1. Preparamos la gradilla con 2 tubos de ensayo.

2. Vertemos agua destilada en un vaso de precipitados y con una pipeta cogemos 19,6 mL y lo vertemos en una probeta.

3. Posteriormente echamos 8 gotas del reactivo en el agua de la probeta.

4. Mezclamos un poco.

5. Con la pipeta cogemos 2,5 mL de RT y lo echamos en uno de los tubos de ensayo. Este será el blanco

6. Seguidamente cogemos otros 2,5 mL de RT y se echa en el otro tubo, a continuación con una micropipeta se coge 10 µL de hemoglobin cal (calibrador) y se echa sobre el RT. Se homogeneiza con la micropipeta.

7. Tras ello cogimos otra gradilla con 5 tubos de ensayo y echamos 2,5 mL de RT en cada uno de ellos y solo en uno echamos 10 µL de muestra de sangre, antes se agita un poco y tras echarla sobre el RT se cierra con un tapón y se mueve levemente. Realizamos el mismo movimiento con el blanco y el patrón.

8. Los otros cuatro tubos se reparten a los otros grupos para que echen su cantidad de muestra correspondiente

9.  Vertemos el blanco, el patrón y la muestra en cubetas de espectrofotometría.
10. Ajustamos el blanco, para ello seleccionamos medir blanco, limpiamos la cubeta y sin tocar con los dedos por abajo la metemos en la posición correcta en el compartimento para ello. Cerramos y se ajustará el blanco. Es importante colocarlo de forma que el haz de luz no incida sobre las caras opacas.
11. Tras ello sacamos el blanco y con el mismo método metimos el patrón. Se obtuvo 1,028 de absorbancia.
12. Se realizó lo mismo pero con la muestra y se obtuvo 2,084 de absorbancia.

Agua destilada

RT preparado

Preparando el tubo de blanco

Blanco y patrón

Añadiendo muestra

Tubos para toda la clase

Cubetas

Blanco ajustado

Metiendo el blanco

Absorbancia del patrón

Absorbancia de la muestra

Tras ello y con la siguiente fórmula se obtiene la concentración:

(Absorbancia de la muestra/Absorbancia del patrón) *15 = 30.41 g/dL

Tras tener este dato lo comparamos con los valores de referencia:

• Hombres: 14 - 18 g/dL
• Mujeres: 12 - 16 g/dL

OBSERVACIONES

• La medición obtenida fue demasiado alta por lo que podría deberse a que la sangre la teníamos en el laboratorio y llevaba más de un año extraída, cuando en condiciones normales como mucho se habría de esperar unos días máximo.
• No es necesario ajustar el blanco en los siguientes grupos una vez que ya lo ajustamos nosotros.
• Teníamos esa sangre en el laboratorio, pero debe obtenerse sangre por punción venosa y se usan anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato.