PRÁCTICA 16: DETECCIÓN DE LA REACCIÓN DE LA PEROXIDASA EN LEUCOCITOS

11.02.2020

PRINCIPIO

La reacción de peroxidasa, en particular la reacción citoquimicamente significativa de mieloperoxidasa, sirve de indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. El grado de madurez de los granulocitos en maduración puede ser estimado esencialmente según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca. Las peroxidasas son catalasas lisosomales que transfieren el hidrógeno desde un donador adecuado (anteriormente la bencidina cangerígena, aqui: 4-cloro1-naftol) a un peróxido (aquí: peróxido de hidrógeno). Entonces el donador 4-cloro-1-naftol se oxida y se transforma en un colorante insoluble pardo negruzco, que puede utilizarse corno indicador de la correspondiente actividad de peroxidasas. 

MATERIAL

• Lancetas.
• Portaobjetos.
• Cubetas de Hellerdahl.
• Microscopio

REACTIVOS

El kit de tinción contiene 

• Reactivo 1: LEUCOGNOST® POX 4-Cloro-1-naftol  12 x 75 µmol 
• Reactivo 2:  LEUCOGNOST® POX Tris(hidroximetil)aminometano-  HCl solución tampón 10 ml 
• Reactivo 3:  LEUCOGNOST® POX Solución de peróxido de hidrógeno 5 ml 

MUESTRA:

• Sangre periférica.

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Preparación de la solución fijadora LEUCOGNOST

Esto lo realizó un grupo de clase que consiste en mezclar 9 partes de metanol por una de formol, como hicieron un total de 200 mL se preparó con 20 mL de formol y 180 mL de metanol y seguidamente se repartieron alícuotas para cada grupo de clase.

Preparación de solución de tinción.

Ya cada grupo preparó una solución de tinción para cada uno, se añaden juntos:

• Disolvimos el contenido total del frasco de reactivo 1 (4-cloro-1-naftol) e, 15 mL de etanol
• Añadimos a una cubeta de 60 ml de  Hellendahl. 
• Añadimos 45 mL de agua destilada revolviendo
• Añadimos 10 gotas de reactivo 2 (tris(hidroximetil)amino-metano-HCl solución tampón) revolviendo. 
• Añadimos 2 gotas de reactivo  3 (solución de peróxido de hidrógeno) revolviendo.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Hemos utilizado sangre capilar con la que hemos realizado un frotis. (el cual se realizó media hora antes de iniciar esta práctica)

Los frotis han de fueron secados al aire durante 30 minutos, debiéndose fijar éstos antes de la reacción citoquímica propiamente sumergiéndolas durante 3 minutos en solución fijadora.

Enjuagamos con agua corriente del grifo 30 segundos y luego lo secamos al aire 

TINCIÓN EN LA CUBETA DE 60 mL DE HELLERDAHL.

NOTA: Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de soluciones, además que para conseguir un óptimo resultado de tinción, deberían respetarse los períodos indicados.

Primero, tras prepararlo todo y haber dejado secar las extensiones sanguíneas el tiempo correspondiente, se enjuagó 3 minutos en la solución fijadora. Tras ello se enjuagó 10 segundos con agua destilada y se dejó secar.
Luego  se introdujo en la solución de tinción recién preparada 10  minutos, se enjuaga con agua destilada 10 segundos y se seca al aire. Seguidamente se realiza una contratinción con hemalumbre en solución según Mayer 2 minutos, se enjuaga con agua corriente del grifo 5 minutos y por ultimo se vuelve a secar al aire.

RESULTADO.

Tras secarse la preparación observamos con el objetivo de 40x donde se podían observar diversas granulaciones.

EVALUACIÓN. 

Las poblaciones leucémicas de blastos que reaccionan de forma peroxidasapositiva en parte o en su totalidad son indicadores de la leucemia mieloica aguda (LMA/AML). Los linfoblastos y las células linfoideas importantes para al diagnóstico diferencial siempre deberían ser peroxidasa-negativas, y los bastoncillos de Auer - que acompañan una leucemia mieloica aguda - tendrán una tinción especialmente intensa. No obstante, en caso de presentarse una reacción negativa de peroxidasas, no se podrá excluir sin más la presencia de una leucemia mieloica aguda. Para poder clasificar con claridad las diferentes formas de la leucemia mieloica aguda (mieloblástica, promielocítica y mielomonocítica) habrá que realizar una reacción adicional de esterasa. Si la reacción de esterasas es positiva en menos del 50 %, se tendrá que obtener el porcentaje exacto de células peroxidasapositivas en la correspondiente población de blastos realizando un contado. Sin embargo, no será necesario diferenciar las células peroxidasa/esterasa-positivas adicionalmente según los grados de intensidad. 

PRÁCTICA 15: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE FIBRINÓGENO

10.02.2020

PRINCIPIO DEL MÉTODO

El Fibrinógeno, en presencia de un exceso de trombina, se transforma en Fibrina.  El tiempo de formación del coágulo es inversamente  proporcional a la concentración de Fibrinógeno presente en la muestra de plasma. La determinación de fibrinógeno por el tiempo de coagulación de trombina, está basada en el método descrito por Clauss. 
En presencia de altas concentraciones de trombina, el tiempo necesario para la formación del coágulo en el plasma diluido es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno.

SIGNIFICADO CLÍNICO 

El Fibrinógeno (Factor I), proteína sintetizada en el hígado, es un componente de la sangre utilizado para formar el coágulo. Su determinación nos ayuda a evaluar las alteraciones en los mecanismos de coagulación.  La concentración de fibrinógeno se incrementa en inflamaciones agudas y embarazo; por el contrario se observan valores bajos en  terapias trombolíticas, enfermedades hepáticas, disfibrinogenia congénita, DIC (Coagulación intravascular diseminada) y  pancreatitis.

REACTIVOS 

R 1 Trombina bovina                             100 u NIH/mL

 R 2 Tampón Imidazol, Azida sódica                    

R3 Solución Caolín   

                   

Opcional
COAGULATION  CAL            REF: 1709101 CONTROL NORMAL             REF: 1709104 CONTROL PATHOLOGIC     REF: 1709106

MATERIAL 

Coagulómetro 

Micropipetas y puntas

Gradillas

Tubos eppendorf
 
MUESTRAS  Plasma obtenido por punción venosa diluido 1/10 

PROCEDIMIENTO

Lo primero que hicimos fue reconstituir el R1 en 2,0 mL de agua destilada. Luego tapamos y mezclamos suavemente hasta disolver su contenido, y lo dejamos reposar 15 minutos.

El R2 lo agitamos antes de usar. 

R3: Listo para su uso.

1. Preparamos una dilución 1/10 de la muestra y los Controles en Tampón Imidazol:  50 µL de muestra o control + 450 µL de R2 (tampón imidazol).

2. Luego un grupo de clase se encargó de preparar las siguientes diluciones del  Calibrador  en Tampón Imidazol: (con la construcción de su correspondiente curva de calibración.

3. Luego  traspasamos a otro tubo eppendorf 0,2 mL de cada dilución y añadimos 20 µL de R3 y atemperar a 37ºC durante 5 minutos en el coagulómetro, previamente le hemos introducido en la cubeta la varilla de metal.

4. Añadimos 0,1 mL de reactivo R1, con previa inserción de la cubeta y pulsado RESET. Tras caer el R1 empieza a correr el tiempo hasta parar en la formación de coágulos.

Nuestros valores obtenidos fueron:

Muestra: 17,2 segundos
Normal: 28,2 segundos
Patológico: 32,4 segundos

CÁLCULOS 

1. Calcular la media de los duplicados de los tiempos de coagulación, inmediatamente después de finalizar la reacción. Utilizar los cinco puntos del calibrador para crear una curva de los tiempos obtenidos frente a los valores de concentración de Fibrinógeno de cada dilución del  Calibrador (mg/dL).
2. Trazar la mejor curva. Examinar la curva y, si es necesario, omitir los puntos no lineales. La curva final debe constar de tres puntos consecutivos como mínimo. La creación de la curva sólo con los puntos más lineales producirá la mejor recuperación en los controles y las muestras de paciente.

4 La concentración de Fibrinógeno en la muestra se calcula por interpolación de su tiempo de coagulación en la curva de calibración.
5. Si los tiempos de dilución 1/10 se encuentran fuera de la curva lineal, preparar diluciones a 1/5 ó 1/20, según sea necesario. Si la muestra se diluye a 1/5 dividir el resultado de la curva por 2; si la muestra se diluye a 1/20, multiplicar el resultado por 2 para obtener el resultado final.

RESULTADO:

Además de por interpolación también se puede hacer por la fórmula de la gráfica que nos proporciona excell que nos dará un resultado bastante más preciso, los resultados fueron:

La función es  y= -0,1169 X + 56,108

Para el suero normal → Tiempo = 28,2s

x = (28,2-56,108) / (-0,1169) = 238,73 mg/dL

Para el suero patológico → Tiempo = 32,4s

x = (32,4-56,108) / (-0,1169) = 202,8 mg /dL

Para nuestra muestra → Tiempo = 17,2s

x = (17,2-56.108) / (-0,1169) = 332,83 mg/dL

PRÁCTICA 14: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL TIEMPO DE PROTOMBINA

31.01.2020

PRINCIPIO DEL MÉTODO  

Basado en el test de A. Quick, el ensayo mide el tiempo transcurrido hasta la formación del coágulo después de la mezcla del plasma con Tromboplastina (un extracto de tejido rico en Factor Tisular, fosfolípidos y calcio). La coagulación se inicia por activación del FVII con el Factor Tisular. 

Material necesario:

• Coagulómetro
• Micropipetas y puntas
• Baño termostático

Reactivos:

PT : Tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro cálcico, inhibidor de heparina, tampón y conservantes. Liofilizado.  MUESTRAS Plasma previamente separado y contenido en citrato trisódico.

PROCEDIMIENTO

Encendemos el coagulómetro.
Lo primero que hicimos fue reconstituir el contenido de un vial con 4 mL de agua destilada, luego tapamos el vial y agitamos hasta disolver el contenido evitando la formación de espuma. 

Luego precalentamos a 37 º C el reactivo PT y la muestra durante 7 minutos. 

Introducimos en una cubeta del coagulómetro la varilla de metal, y seguidamente iniciamos el test PT mezclando 200µl de PT con 100µl de plasma citrado precalentado. Para ello se deposita primero el reactivo, se pone la cubeta debajo de la tapadera, se pulsa el botón RESET y se echa seguidamente la muestra a través del agujero de la tapadera, una vez depositado automáticamente empieza a contar el tiempo transcurrido en el momento de la mezcla. Detener en el momento de la formación del coágulo.  El resultado fue 12,9.

RESULTADOS 

Los valores se pueden expresar en segundos, en Tasa de PT (PR,  comparando con un valor de referencia), porcentaje de actividad (%, con curva de calibración utilizando un plasma (pool o liofilizado) de referencia),  o en tasa internacional normalizada (INR): 

INR: ( PT (seg)/PT referencia (seg)) ^ISI

El ISI (Indice de Sensibilidad Internacional) depende del lote de reactivo y del sistema analítico utilizado. Spinreact indica para cada lote de reactivo PT un valor de ISI genérico para detección foto-óptica del coágulo.

VALORES DE REFERENCIA 

Utilizando el coagulómetro BioBas10, a partir de 20 muestras normales se determinó el rango de referencia (95% confianza): 11,1-14,3 segundos.

Tiempo de protombina normal : 14 ISI: 1.26 Realizando la fórmula descrita arriba el resultado fue de 1, por lo que el tiempo de protombina de dicho paciente es patológico.

PRÁCTICA 13: TIEMPO DE SANGRÍA

27.01.2020

OBJETIVO

Determinar el periodo de tiempo desde que se realiza una pequeña  incisión en la piel y el momento en que finaliza el sangrado. (Tiempo de sangría), vamos a usar dos métodos, el Ivy y Duke.

FUNDAMENTO

Es la única prueba que permite medir in vivo la reacción plaqueta-endotelio y demuestra la capacidad
hemostática de las plaquetas. Se usa la técnica de Ivy que consiste en practicar una  incisión en la cara anterior de antebrazo mediante una hoja especial de 1 cm de  longitud y 1 mm de profundidad.
El tiempo de hemorragia normal es entre 3 minutos y 30 segundos, y 8 minutos y  30 segundos. Las causas de prolongación del tiempo de sangría son las alteraciones en la pared vascular, trombocitopenias, defectos en la agregación o adhesión plaquetar.

Material necesario:

• Cronómetro
• Papel de filtro
• Lanceta
• Algodón
• Alcohol de 70º

PROCEDIMIENTO

Método Ivy:

En él determinamos el tiempo de sangría usando la técnica en el antebrazo, primeramente usamos un xxxx y lo pusimos a una presión de 40, luego desinfectamos la zona con algodón y realizamos la punción con lanceta, es importante no realizar la punción donde no haya venas ni vello.
Seguidamente ponemos el cronómetro y retiramos la sangre con un papel de filtro cada 30 segundos sin tocar el brazo (por capilaridad) y vamos realizando esto cada 30 segundos hasta que deje de sangrar.
Una vez acabado anotamos el tiempo, en mi caso fue de 1 minuto y 44 segundos.

Valores normales: entre 3,5 min - 8,5 min.

NOTA: El tiempo fue menor en nuestro caso debido a que la lanceta que utilizamos era de menor calibre que la que se suele usar en la técnica normalmente.

Método Duke

Este método utiliza el tiempo de sangría realizando una punción en el lóbulo de la oreja donde realizamos la desinfección con alcohol y un algodón, luego pusimos un portaobjetos detrás para tener soporte y realizamos la punción con la lanceta, luego se procede de la misma manera que con el método Ivy, quitando la sangre cada 30 segundos. El resultado fue de 1 minutos y 34 segundos.

PRÁCTICA 12: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (APPT)

17.01.2020

OBJETIVO

Medir el tiempo de tromboplastina parcial activa, que es una prueba que se suele realizar junto con el tiempo de tromboplastina y el fibrinógeno antes de someter a un paciente a una intervención quirúrgica.

PRINCIPIO DEL MÉTODO

 Los factores intrínsecos de la coagulación se activan en presencia de  un complejo fosfolipídico y un activador soluble en plasma citratado; se mide el tiempo transcurrido después de la adición del cloruro cálcico  (CaCl2) hasta la formación del coágulo de fibrina

SIGNIFICADO CLÍNICO

La medida del tiempo de APTT, es la determinación más común junto con la PT, sirve para determinar trastornos de la coagulación y es particularmente sensible a los defectos de la coagulación intrínseca (Factores VIII, IX, XI, XII). Se usa normalmente para la monitorización de las terapias anticoagulantes con heparina. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Material necesario:

• Coagulómetro
• Pipeta de 100 µL y puntas.

Reactivos:

R1: ácido elágico. Tampón y conservantes

R2: cloruro cálcico

Muestra: plasma con citrato (no EDTA)

PROCEDIMIENTO:

Encender el coagulómetro y mientras atemperar los reactivos y muestra, primero se coloca con ayuda de unas pinzas una varilla de metal en el interior del tubo, seguidamente se coloca en el tubo del coagulómetro 100 µL de muestra con 100 µL de R1 y esperar 5 minutos para que se atempere, seguidamente se pone el tubo bajo la pequeña tapadera del coagulómetro y se tapa, pulsamos el botón reset y le echamos 100 µL de R2, y empezará a automáticamente a contar el tiempo, se paró en 65.1 segundos con lo que podemos concluir que es un resultado patológico. Según la fórmula la tasa de APPT es la siguiente:

Tasa APPT = APTT presente/ APPT de plasma normal = 65.1/28.6 = 22,8%